吡咯喹啉醌产生菌的筛选和菌种鉴定（一） 为了筛选产生吡咯喹啉醌

为了筛选产生吡咯喹啉醌，吡咯英文名为pyrroloquinoline quinone（PQQ）的喹啉醌产菌株并提高PQQ发酵产量，该研究建立了一种快速的生菌高效液相色谱法检测PQQ，并采用了以甲醇为唯一碳源的选和选择性培养基，利用光谱法对样品进行初筛，菌种鉴定高效液相色谱法（HPLC）对初筛得到的吡咯结果再进行复筛。该研究还对筛选得到的喹啉醌产菌株发酵产PQQ的培养基进行了优化。研究结果显示：从样品中筛选得56株PQQ产生菌，生菌摇瓶产量最高的选和一株为20.6 mg /L，通过16s rDNA 测序分析，菌种鉴定鉴定该菌株为Methylopila sp.属。吡咯对培养基成分中的喹啉醌产碳源甲醇进行了优化研究，当甲醇体积浓度为2.5%时，生菌PQQ产量最高，选和为26.3 mg /L，菌种鉴定相比于初始甲醇1.0%提高了28%。该研究建立的高效液相色谱法为PQQ高产菌株的筛选提供一种快速检测方法，筛选到的菌株具有较高的甲醇耐受力和PQQ生产潜力，为之后的PQQ发酵研究提供参考。

吡咯喹啉醌，英文名为pyrroloquinoline quinone（PQQ），作为许多细菌脱氢酶（甲醇脱氢酶，乙醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶等）的辅助因子于1964年首次被发现，它是继吡啶核苷酸和核黄素之后的第三种氧化还原酶的辅酶。PQQ在生物界的分布极为广泛，在动植物和微生物细胞中均发现其存在，但仅有部分革兰氏阴性细菌能合成PQQ。

在具有合成PQQ能力的细菌中，绝大部分只能合成痕量的PQQ以供给细胞生长，只有少部分可以生产过量的PQQ，并将其排泄到培养基中，其中以甲基营养菌的合成能力最强，如甲基菌属（Methylobacill），甲基单胞菌属（Methylomonas），嗜甲基菌属（Methylophilus）和甲基杆菌属（Methylobacterium）等。此外，在纳豆，青椒和猕猴桃等植物体内也含有微量的PQQ，并且牛奶和人类的母乳中也存在较高浓度的PQQ。近几十年来的研究发现PQQ具有多种生理功能，它是许多细菌脱氢酶的辅助因子，参与细胞的电子呼吸链传递；PQQ可以提高微生物细胞的抗逆性，并提高宿主菌的抗氧化能力[18]；PQQ还是动植物刺激或生长因子；此外，PQQ与葡萄糖脱氢酶结合形成PQQ-GDH全酶，可用作检测葡萄糖的生物传感器，也可用作生物燃料电池。

由于目前PQQ化学合成步骤复杂，副产物多，而微生物发酵生产PQQ成本低，步骤少，产物分离更容易，因此微生物发酵法成为最有前景的工业化生产路线。虽然对PQQ的研究已有几十年，但其生物合成的具体过程尚未完全阐明，从环境中筛选高产野生菌依然是必不可少的。1992年，URAKAMI等筛选到一株PQQ产生菌，经鉴定为生丝微菌Hyphomicrobium sp.TK0441，优化培养基后在30 L发酵罐上发酵14天后PQQ产量可达到1 g/L。司振军等[22]从土壤中筛选到一株甲基营养菌，经鉴定为Methylobacillus sp.zju323,未经优化的PQQ摇瓶产量为23.2 mg/L，在已报道的研究中属于高水平。本研究建立了一种高效液相色谱法用来快速检测PQQ，并从土壤样品中筛选得到一株PQQ高产菌，并对其进行了菌种鉴定和培养基优化，为后续进行PQQ的进一步生产研究提供依据。

1材料与方法

1.1材料与试剂

细菌样品来自于无锡生产甲醇工厂附近的土壤和污水。PQQ标准品购自于Sigma公司，其他试剂均购自于国药集团。

1.2仪器与设备

G180T灭菌锅，美国致微仪器有限公司；高速冷冻离心机，美国赛默飞世尔科技公司；酶标仪，美国BioTek公司；Agilent-1260高效液相色谱仪，美国安捷伦科技公司。

1.3培养基

筛选培养基：甲醇30 mg /L，(NH4)2SO4 3 g/L，Na2HPO4·12H2O 3 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L ，KH2PO4 1.4 g/L，微量元素液 1 mL/L。固体培养基添加2%的琼脂粉。

种子培养基：甲醇10 mg /L，(NH4)2SO4 3 g/L，Na2HPO4·12H2O 3 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，KH2PO4 1.4 g/L，微量元素液 1 mL/L。微量元素液：CaCl2·2H2O 30 mg/L，MnCl4·4H2O 5 mg/L发酵培养基：在种子培养基的基础上加入1 mL维生素液，维生素液配方（mg/L）：核黄素200，对氨基苯甲酸200，盐酸硫胺素400，烟酸400，盐酸吡哆醇400，泛酸钙400，叶酸2，生物素2，肌醇2000。

1.4实验方法

1.4.1 PQQ产生菌初筛方法的确立

光谱法：对PQQ标准品进行全波长扫描，发现其在249 nm和330 nm处有两个吸收峰，将200 μ L PQQ标准品溶液或发酵离心上清液转移至96孔板中，用酶标仪检测 OD330与 OD249，并将空白培养基以同样的条件处理和检测，从而减去培养基吸光值的干扰。

1.4.2 HPLC法检测PQQ

由于PQQ的结构上连有3个—COOH，因此其易溶于水，极性较大，在普通的C18反相色谱柱上不保留。目前采用较多的是离子色谱对法来检测PQQ，但是离子色谱对平衡时间长，操作复杂且对柱子也有局限性；还有采用加酸调节pH来使PQQ保留在色谱柱上，但这使得峰形拖尾严重并且重现性不好。为此本实验选择亲水色谱柱来解决PQQ难以在色谱柱上保留的问题。以水为流动相，通过COSMOSIL Packed Column 5C18-PAQ反相色谱柱，测定PQQ在249 nm和330 nm的吸光值，根据出峰面积确定其浓度。利用安捷伦1260系列高效液相色谱仪测定PQQ含量，进样量20 μ L，温度30 ℃，流动相为0.05 mol/L乙酸：0.05 mol/L乙酸铵=30：70，流速1 mL/min，在波长249 nm和330 nm下检测PQQ标准品和样品含量。

1.4.3菌株的筛选

将样品制成适当浓度梯度的稀释液，涂布于甲醇筛选培养基平板上，30 ℃培养3~5天，分别挑取不同形态的单菌落接种到种子培养基中，30 ℃，200 r/min 培养3~5天，将发酵液离心取上清液，用光谱法快速检测PQQ含量，再用HPLC法对PQQ产量较高的菌株进行复筛。

1.4.4菌种的鉴定

将PQQ产量最高的菌株在固体培养基上划线，30 ℃培养3~5天，利用普通光学显微镜观察菌体形态特征。取单菌落接种到摇瓶培养基中，30 ℃培养，当菌体OD600为0.5~1时，取3 mL发酵液，10000 r/min离心1 min，弃去上清液，收集菌体，按照细菌基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN公司）提取DNA，利用细菌通用引物 27F：5'-AGA GTT TGA TCM TGGCTC AG -3'；1492R：5' -GGT TAC CTT GTT ACGACT T-3'，通过 PCR 反应扩增该菌株的16s rDNA序列，将产物委托上海生工测序，将测序结果在NCBI网站中进行BLAST比对，用软件MEGA进行系统进化树的构建。

1.4.5甲醇含量对菌体生长和PQQ产量的影响

对培养基中的唯一碳源甲醇进行优化，研究甲醇的不同添加体积浓度（0.5%，1%，1.5%，2%，2.5%，3%，3.5%，4%）对菌体生长和PQQ产量的影响。

2结果与分析

2.1光谱法检测PQQ

研究建立了基于光谱法检测PQQ的快速筛选方法，通过全波长扫描发现PQQ在249 nm和330 nm左右有两个吸收峰。考虑到发酵液中含有蛋白，核酸等在249 nm左右有吸收值的物质，而在330 nm处有吸收值的物质较少，因此，本实验选择研究PQQ浓度和OD330的关系。通过酶标仪检测不同浓度 PQQ标准品的OD330（检测样品时要减去空白发酵培养基的吸光值以除去干扰），发现在330 nm下PQQ浓度与OD330关系为y=0.0218x-0.0354 (R2=0.9957)。当PQQ浓度在2.5~50 mg/L之间时，二者呈现良好的线性关系，由于野生菌产PQQ量多在1~20 mg/L左右，因此使用本方法进行高通量筛选的初筛具有良好的可行性。

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